Di film yang berlatar belakang tahun 2009-2012, di hampir seperempat bagian pertama, Will Smith bermain tunggal, sambil dengan pelan-pelan menceritakan kembali latar belakang penyebaran virus di kota New York itu. Jadi, pada beberapa adegan, film ini menggunakan alur mundur.
Robert Neville (diperankan oleh Will Smith) adalah ahli virus yang bekerja di militer Amerika. Dia tinggal di New York bersama istrinya Zoe (diperankan oleh Salli Richardson), putrinya Marley (diperankan oleh Willow Smith) dan anjingnya Samantha. Ketika tiba-tibaZoe dan Marley harus segera diungsikan dengan helikopter dari kota New York, karena ada wabah virus mematikan yang telah menginfeksi hampir keseluruhan penduduk kota New York ini. Mereka yang belum terinfeksi, berusaha meninggalkan kota itu dengan menumpang angkutan apapun yang ada. Dan keluarga Robert mendapat kesempatan untuk naik helikopter, karena posisi Robert yang seorang letkol. Malangnya, helikopter yang membawa keluarganya itu meledak di udara, hanya beberapa saat setelah terbang.
Virus yang mematikan ini adalah virus mutasi yang telah menginfeksi hampir 90% populasi umat manusia (mudah-mudahan flu A tidak ada yang berakhir seperti ini ya). Dari 600 juta orang yang selamat, hanya 12 juta orang yang memiliki kekebalam alami dan bisa selamat. Dan Robert termasuk dalam kategori yang 12 juta ini.
Mereka yang ter-infeksi akan berubah menjadi mahluk ganas yang haus darah. Dimana korban berubah jadi botak, pucat dan pemakan daging. Satu-satunya yang mereka takutkan hanyalah cahaya matahari. Itulah sebabnya mereka disebut Darkseeker. Tapi para Darkseeker ini bukanlah sekedar hewan yang berbentuk manusia. Tapi mereka juga punya keahlian dan kepintaran seperti yang dimiliki manusia.
Ia berhasil menangkap seorang wanita yang merupakan Darkseeker. Ia berniat menjadikannya bahan percobaan untuk sebuah antivirus yang sudah ditemukan dan diuji-cobakannya pada tikus. Antivirus itu menunjukkan sedikit kemajuan, dimana tikus itu tidak lagi terlalu botak dan tidak lagi terlalu pucat. Perilakunya juga tidak terlalu agresif. Ia ingin melihat pengaruh antivirus itu terhadap Darkseeker.
Tapi ternyata, Darkseeker perempuan yang ditangkapnya ini memiliki pasangan, Alpha Male. Dia sangat marah karena Robert menculik pasangannya. Tapi ia tidak bisa berbuat apa-apa, karena takut terhadap sinar matahari. Tapi Alpha Male sangat marah dan berniat untuk membalas dendam dengan menemukan Robert di waktu malam.
Untuk menjaga kewarasannya, Robert menempatkan berbagai manekin di toko-toko yang sering ia kunjungi. Misalnya di toko penyewaan video. Dia memberi nama semua manekin itu dan menyapa ’mereka’ setiap kali ia bertemu. Dengan begitu, Robert tidak merasa terlalu kesepian. Dia juga rajin siaran dalam sebuah frekuensi radio. Ia memanggil siapapun yang masih hidup dan bisa mendengarnya. Ia menjanjikan tempat persembunyian dan suplai makanan. Ia berharap masih ada manusia lain yang selamat dan bisa menemukannya.
Ia tersadar kembali saat mendengar alarm yang mengingatkannya untuk segera menutup pintu besi di tempat persembunyiannya. Alarm pertama yang mengingatkan untuk segera kembali ke rumah, tidak didengarnya. Dalam keadaan pusing dan berdarah, Robert berusaha membebaskan diri. Tapi waktunya terlalu sempit dan ia pun diserang oleh serombongan anjing Darkseeker ganas, yang ternyata sudah dikoordinir oleh Alpha Male.
Samantha yang berusaha menolong Robert tergigit oleh salah satu dari anjing-anjing terinfeksi itu dan terinfeksi. Robert sangat sedih karena satu-satunya yang menjadi temannya, harus dibunuhnya karena terinfeksi. Kalau Samantha tidak dibunuh, ia juga akan berubah menjadi Darkseeker. Anjingnya yang setia itu mati dalam pelukannya dengan cara dicekik. Adegan inilah yang paling mengharukan bagiku.
Robert memeluk Samantha sambil menyanyikan lagu Bob Marley yang Every Little Thing Is Gonna Be Alright. Ketika perlahan-lahan Samantha berubah menjadi anjing Darkseeker dalam pelukannya dan Robert mencekiknya sambil membuang muka dan meneteskan air mata. Hilanglah sudah sahabat satu-satunya yang masih hidup.
Karena kemarahannya, setelah menguburkan Samantha, Robert dengan putus asa menyerang sekelompok Darkseeker yang dipimpin oleh Alpha Male untuk membalas dendam. Tapi salah satu dari Darkseeker itu berhasil mengalahkannya dan hampir saja membunuhnya. Kalau saja Anna (diperankan oleh Alice Braga) tidak menolongnya dengan menariknya ke dalam mobil. Dengan terburu-buru Anna menanyakan padanya, dimana lokasi persembunyiannya. Robert yang sudah lemas karena terluka pun memberitahukannya. Dia masih sempat memperingatkan Anna agar tidak langsung ke tempat persembunyian itu, tapi harus berputar-putar saja dengan mobil, sampai matahari terbit. Karena para Darkseeker itu bisa saja membuntuti mereka. Tapi Anna yang sudah ketakutan tidak mendengarnya, ia langsung saja menuju ke tempat yang sudah diberitahukan Robert.
Ternyata Anna adalah salah satu diantara mereka yang memiliki kekebalan alami terhadap virus ini. Ia datang bersama seorang anak bernama Ethan (diperankan oleh Charlie Tahan) yang ternyata memiliki sebuah radio. Lewat radio itu lah mereka mendengarkan panggilan Robert selama ini dan kemudian memutuskan untuk datang menemuinya. Mereka berniat pergi ke sebuah kamp pengungsi di Vermont. Dia berniat mengajak Robert kesana juga dan berkumpul dengan orang-orang selamat lainnya. Tapi Robert tidak percaya kalau masih ada yang selamat di dunia ini. Dan ia menolak untuk pergi bersama mereka. Ia mempersilahkan Anna dan Ethan untuk pergi kesana tapi ia tidak berniat untuk ikut serta. Dia akan tetap tinggal disana dan berusaha menemukan antivirus nya.
Benar saja, ternyata kelompok Alpha Male mengetahui tempat persembuyiannya dan menyerang rumah itu pada malam berikutnya. Rupanya Anna tidak memperhatikan ketika Robert menyuruhnya untuk berputar-putar sampai pagi dan jangan langsung menuju ke tempat persembunyian itu. Dan kelompok Alpha Male membuntuti mereka sampai ke tempat itu, kemudian merencanakan penyerangan besar-besaran kesana.
Robert, Anna dan Ethan pun tersudut sampai ke laboratorium tempat Robert menyimpan Darkseeker perempuan yang berhasil ditangkapnya. Tempat itu dikelilingi kaca tahan peluru, sehingga para Darkseeker itu perlu waktu sedikit lama untuk bisa memecahkannya.
Ketika itu Robert melihat kalau Darkseeker perempuan itu sudah mengalami perubahan bentuk. Ciri-ciri Darkseeker sudah makin menghilang meskipun belum sepenuhnya. Saat itulah ia menyadari kalau percobaannya sudah berhasil dan ia tidak ingin hasil percobaan itu menjadi sia-sia. Maka ia mengambil sampel darah dari Darkseeker yang sudah mulai sembuh itu dan menyerahkannya kepada Anna.
Lalu ia memasukkan Anna dan Ethan ke sebuah celah tersembunyi yang aman. Robert kemudian mengambil granat yang disimpannya di laci meja dan meledakkan tempat itu bersama dengan para Darkseeker yang mencoba masuk, agar perjalanan Anna menuju ke kamp itu selamat.
Di akhir cerita ditunjukkan kalau Anna dan Ethan menemukan kamp pengungsi itu. Dimana ia menyerahkan anti virus yang sudah diberikan Robert kepadanya, sehingga mereka semua bisa selamat. Para penghuni kamp itu kemudian menjadikan Robert sebagai legenda karena telah menyelamatkan mereka, keturunan manusia yang tersisa.